試讀20年12月14日新版《非洲豬瘟診斷技術(shù)》
發(fā)布日期：2021-05-14
國家標準即中華人民共和國國家標準簡(jiǎn)稱(chēng)國標 ，是指由國務(wù)院標準化行政主管部門(mén)或者其他有關(guān)主管部門(mén)對需要在全國范圍內統一的技術(shù)要求制定的技術(shù)規范 。2020年12月14日國家標準化管理委員會(huì ) ，2020年28號公告正式發(fā)布新版《非洲豬瘟診斷技術(shù)》國家標準(GB/T 18648-2020) ，代替GB/T 18648-2002 ，并于2020年12月14日正式實(shí)施 。
本標準的范圍
本標準規定了非洲豬瘟的臨床診斷和實(shí)驗室診斷方法；臨床診斷依據臨床癥狀和病理變化 ，可初步判定為疑似非洲豬瘟病例 ，然后進(jìn)行實(shí)驗室診斷 ，對病例作出是否為非洲豬瘟的診斷 。本標準適用于家豬和野豬的診斷與監測 ，并不適用于人 、其他動(dòng)物 、植物以及飼料等 。
本標準的方法和商品化試劑
1、國標“方法”是根據基礎技術(shù)和理論進(jìn)行比較 ，規定不同方法的檢測結果之間的判定優(yōu)先權 ，與商品化試劑 、儀器設備 、工具 、人員無(wú)關(guān)。方法用于“檢測”，對臨床病例的“確診”需要綜合判定 。
2、CNAS認可實(shí)驗室根據“檢測和校準實(shí)驗室能力認可準則(ISO/IEC 17025:2017)”進(jìn)行檢測 ，應使用“國際標準、區域標準或國家標準”發(fā)布的方法 。
3、采用國標方法開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的商品化試劑 ，可稱(chēng)為國標試劑 ；采用非國標方法或者原理開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的商品化試劑，可稱(chēng)為非標試劑。
本標準中方法的分類(lèi)
本標準中規定的用于非洲豬瘟實(shí)驗室診斷的“方法 ”，從檢測靶標物質(zhì)的分子水平上 ，可以分為三大類(lèi) ，即核酸檢測方法、病毒（完整顆粒）檢測方法和抗體檢測方法 。
考慮到生物安全和相關(guān)政策要求 ，本標準不支持病毒分離、培養和鑒定等基礎病毒學(xué)操作技術(shù)作為非洲豬瘟的診斷方法 ，亦未提供ASFV是否為活病毒 、是否具有感染力的檢測方法 。目前符合相關(guān)政策要求和生物安全要求 ，同時(shí)能夠滿(mǎn)足復養復產(chǎn)需要的方法是投放 “哨兵動(dòng)物”，相當于病毒學(xué)中的動(dòng)物感染實(shí)驗 ，檢測環(huán)境中是否存在具有感染力的活的非洲豬瘟病毒顆粒 。
1、核酸檢測方法
普通PCR方法、熒光PCR方法和熒光RAA方法 ，檢測靶標非洲豬瘟病毒的遺傳物質(zhì)即脫氧核糖核酸（DNA）的一段序列 ，可簡(jiǎn)稱(chēng)為核酸檢測（見(jiàn)標準7、8、9） 。
本標準中核酸檢測方法的檢測靶標均為ASFV編碼P72蛋白基因即B646L ，且均給出了引物、探針等序列 ，擴增片段位置和長(cháng)度各不相同 ，見(jiàn)圖1 。
那么以檢測ASFV其它基因序列為靶標的商品化試劑均為非標試劑 。
圖1 核酸檢測方法檢測ASFV B646L的長(cháng)度和相對位置
2、病毒（完整顆粒）檢測方法
高敏熒光免疫分析法和夾心ELISA抗原檢測法 ，檢測靶標為完整的病毒顆粒 ，見(jiàn)圖2 ，可簡(jiǎn)稱(chēng)為病毒（完整顆粒）檢測（見(jiàn)標準10 、11） 。
圖2 左側為ASFV病毒超薄切片透射電鏡圖；右側為模式圖
3、抗體檢測方法
間接ELISA抗體檢測方法 、阻斷ELISA抗體檢測方法 、夾心ELISA抗體檢測方法和間接免疫熒光法 ，檢測靶標為豬感染（或免疫）病毒后體內產(chǎn)生的特異性抗體 ，可簡(jiǎn)稱(chēng)為抗體檢測 。
本標準規定的抗體檢測方法又可分為全病毒特異性抗體檢測方法（見(jiàn)標準15，感染ASFV的細胞）和病毒單一結構蛋白特異性抗體檢測方法（見(jiàn)標準12、13、14和15感染重組病毒（表達ASFV蛋白） 。
本標準規定的病毒結構蛋白抗體為P54、P30特異性抗體。
本標準方法檢測結果判定的等效性和優(yōu)先權
核酸、病毒（完整顆粒）和抗體三大類(lèi)方法均可用于實(shí)驗室診斷 ，使ASFV的檢測國家標準更具有適用性 ，不同層級的實(shí)驗室可根據實(shí)際條件 、檢測需求和目的進(jìn)行選擇 ，同時(shí)在綜合判定（見(jiàn)標準16）中也依據不同檢測方法的最低檢出限規定了不同方法檢測結果之間的判定優(yōu)先權和終審權 。
核酸和病毒（完整顆粒）檢測方法均為陽(yáng)性具有等效性：核酸檢測方法（普通PCR方法 、熒光PCR方法 、熒光RAA方法）和病毒檢測方法（高敏熒光免疫分析法 、夾心ELISA抗原檢測方法） ，任何一種方法檢測陽(yáng)性的 ，可診斷為ASF病例 。
核酸和病毒（完整顆粒）檢測方法檢測結果不同時(shí)的判定優(yōu)先權：當檢測結果不一致時(shí) ，普通PCR方法 、高敏熒光免疫分析法和夾心ELISA抗原檢測法的任何一種的檢測陰性結果 ，必須服從于熒光PCR方法或熒光RAA方法任何一種陽(yáng)性結果 ，可診斷為非洲豬瘟病毒感染 。
本項規定 ，主要是依據不同方法的檢測靈敏度確定 ，見(jiàn)圖3、4、5 。
圖3 普通PCR與熒光PCR方法最低檢出限的比較
熒光PCR檢測Ct值為31.78、36.89的樣品 ，用普通PCR方法擴增后 ，在瓊脂糖凝膠電泳中幾乎很難看到相應擴增條帶 。
圖4 高敏免疫分析法與熒光PCR方法最低檢出限的比較
熒光PCR檢測Ct值為＜35的樣品 ，用高敏免疫分析法 ，可檢測判定為陽(yáng)性 ；
熒光PCR檢測Ct值為＞35的樣品 ，用高敏免疫分析法 ，可檢測判定為陰性 。
圖5 熒光RAA方法與熒光PCR方法最低檢出限的比較
熒光RAA方法和熒光PCR方法 ，在本次實(shí)驗中檢測結果判定幾乎一致 。（圖3、4、5中的實(shí)驗數據 ，受試劑的質(zhì)量 、樣品數量和質(zhì)量 、操作 、重復次數等因素影響和限制 ，不能完全反應多種方法最低檢出限的相關(guān)性 ）。
抗體檢測方法的陽(yáng)性判定具有等效性：間接ELISA抗體檢測方法、阻斷ELISA抗體檢測方法和夾心ELISA ，任一項檢測抗體陽(yáng)性 ，可診斷為抗體陽(yáng)性 。
ELISA方法檢測結果不同時(shí)的判定優(yōu)先權：三種ELISA抗體檢測方法的檢測結果不一致時(shí) ，所有檢測結果服從間接免疫熒光方法 。
國家高新技術(shù)企業(yè)
農業(yè)部GMP驗收企業(yè)
八項科技研發(fā)專(zhuān)利